Jaroslav Doležel: Otevřeli jsme nový směr výzkumu dědičné informace

Jaroslav Doležel mezi banánovníky v olomouckém skleníku ÚEB

Jeho tým byl také zodpovědný za dodávání izolovaných chromozomů kolegům v Brně a interpretaci získaných výsledků. Co nám pozorování odhaluje? Kam posouvá naše vědění? A překvapilo ho, co pod mikroskopem viděl? 

Média obletěla zpráva, že čeští vědci ukázali strukturu chromozomu v jeho přirozeném stavu. Jaký byl podíl vašeho centra na tomto objevu? 

Důvodem, proč se často a oprávněně mluví o vědcích z Brna, je, že jádro úspěchu spočívá v metodě, která byla k pozorování izolovaných chromozomů využita. Byla to pokročilá environmentální rastrovací elektronová mikroskopie (A-ESEM). Mimochodem, Brno je Mekkou elektronové mikroskopie a asi třetina světové produkce elektronových mikroskopů se vyrábí právě zde (rozhovor s Roderickem Barkerem, který k tomu přispěl, si můžete přečíst zde). Tým docenta Neděly z Ústavu přístrojové techniky AV ČR v Brně environmentální rastrovací elektronový mikroskop naprosto unikátně vylepšil tak, že umožňuje pozorování biologických vzorků co nejblíže jejich přirozenému stavu. Tato nová mikroskopická metoda se nazývá pokročilá environmentální rastrovací elektronová mikroskopie (A-ESEM) a dosahuje rozlišení miliontin milimetru.

Při klasické rastrovací elektronové mikroskopii (SEM) jsou vzorky vystavované vysokému vakuu, a proto musí být před vložením do mikroskopu upravované, včetně fixování chemickými látkami, jsou také dehydrovány a pokovovány. Takové úpravy mohou poškodit strukturu biologických vzorků, vylučují pozorování v nativním stavu a samozřejmě zvyšují riziko pozorování artefaktů. Když jsem Ústav přístrojové techniky asi před pěti lety navštívil, bylo mi hned jasné, že metoda vyvinutá Vilémem Nedělou je přesně to, co světové komunitě dosud pro studium chromozomů chybělo. 

Mým hlavním oborem je rostlinná cytogenetika – studium genetického aparátu rostlinných buněk. Celý život studuji chromozomy, ale až do této doby nikdo nemohl chromozomy pozorovat ve vysokém rozlišení a co nejblíže jejich přirozenému stavu tak, jak vypadají během dělení buněk. Z možností, které metoda A-ESEM vyvinutá Vilémem Nedělou nabízí, jsem byl nadšený a už během mé první návštěvy jsme dohodli spolupráci. Publikování výsledků předcházelo pět let výzkumu, na jehož konci jsme se mohli podívat, jak vypadá chromozom v „trojrozměrném“ zobrazení a otevřeli tak nový směr výzkumu dědičného aparátu.  

Pro vaše experimenty jste vybrali ječmen, proč? 

Ječmen se stává významnou modelovou rostlinou pro studium dědičnosti rostlin. Do nedávné doby měl monopol huseníček (Arabidopsis thaliana) s malým genomem, jen asi 150 milionů písmen dědičné informace. Díky vývoji nových technik sekvenování, které mají obrovskou kapacitu, si dnes genetici troufají i na velké genomy a pokud jde o obilniny mírného pásu, modelem se stává ječmen. Jeho genom má asi pět miliard písmen genetické abecedy, sice více než člověk, ale pořád třikrát méně než pšenice. Na rozdíl od pšenice je diploidní, to znamená, že má jen dvě kopie dědičné informace a nevznikl křížením více druhů planých rostlin tak, jako pšenice, která má šest kopií dědičné informace, které získala od tří planých předchůdců.  

V průběhu let byla vytvořena řada zajímavých mutantů ječmene, genové banky uchovávají staré krajové odrůdy a položky ječmene z celého světa. Díky tomu je možné charakterizovat genetickou diverzitu tohoto druhu a využívat ji pro izolaci a studium funkce genů. Ječmen je pro nás odrazovým můstkem ke studiu složitého genomu pšenice. Genomem ječmene se zabýváme dlouhodobě a současné studium struktury chromozomů pomáhá vytvořit kompletní obrázek jeho dědičného aparátu.

Když jste ten chromozom uviděl, překvapilo vás, jak vypadá?

Strašně – byl to šok. Několikrát jsme se museli ujistit, že to, co vidíme, není artefakt. Již dříve bylo pomocí klasické rastrovací elektronové mikroskopie zjištěno, že povrch chromozomu není zcela hladký. Ale to, co jsme viděli, mě absolutně šokovalo, protože chromozom vypadá, když to přeženu, jako ježek. Po celém povrchu je pokrytý výběžky o tloušťce asi 30 nanometrů.  

Chromozom: Model upořádání DNA v chromozomech ječmene.
Dvoušroubovice DNA se obtáčí kolem jader nukleozomů a po sobě jdoucí nukleozomy tvoří nukleozomové vlákno o průměru 11 nm. To kondenzuje do vlákna o průměru 80 nm, která se stáčí do závitů o tloušťce 400 nm.

A čím jsou ty „bodlinky“ tvořené?

To nevíme. Zatím máme jenom obrázky. Díky našemu předchozímu studiu a výsledkům jiných laboratoří sice víme, že povrchová vrstva chromozomů je tvořena proteiny, ale jestli je mezi nimi i DNA, to zatím nevíme. Nicméně uspořádání bodlinek – pokud zůstaneme u ježčí terminologie, je poměrně pravidelné, což by přítomnost DNA mohlo naznačovat. 

To ale není jediná záhada: my jsme navíc viděli rovnoměrně rozložené mosty mezi sesterskými chromatidami, které tvoří chromozom, což je překvapivé. Mezi chromatidami by DNA být neměla. V průběhu buněčného dělení se sesterské chromatidy rozcházejí do dceřiných buněk. Pokud by zůstaly spojené molekulou DNA, roztrhla by se. To je ale ve vědě běžné – uděláte jeden krok a objeví se další otázky.   

Myslíte si, že vámi pozorovaná struktura je všeobecně platná, že takhle vypadají i živočišné chromozomy?  

My s živočišnými vzorky nepracujeme, takže je zde prostor pro další kolegy. Nicméně předpokládám, že to tak je. Eukaryotní genom se vyvinul před více než miliardou let a základní procesy podílející se na přenosu dědičné informace jsou stejné napříč současnými druhy. Mechanismus přenosu dědičné informace do dceřiných buněk a potomstev je hodně konzervativní.

Jak moc jste museli upravit vaši metodu třídění chromozomů? Pokud si to dobře pamatuji z vašich přednášek, tak abyste je mohli třídit, musíte je nejprve nabarvit. 

Je to tak. Chromozomy ječmene jsme získávali tříděním pomocí průtokové cytometrie. Aby je přístroj „viděl“, musela být jejich DNA barvena pomocí DAPI, což je fluorescenční barvivo, které se slabě váže na dvoušroubovici DNA. Vazba je tak slabá, že když chromozomy třídíme do nějakého roztoku, DAPI se vymyje. Podobně se například barví DNA spermií, které se třídí pro umělé oplodnění. A rodí se zdravé děti s nepoškozenou dědičnou informací. Tím pádem to nevadilo ani chromozomům ječmene. 

Hlavní modifikací oproti našemu standardnímu postupu izolace a třídění chromozomů rostlin bylo omezení intenzity fixace kořenových špiček ječmene na minimum. Z nich byly chromozomy izolovány mechanicky a dále nebyly nijak neošetřovány. Byly tedy v téměř nativním stavu, ve kterém nebyly dlouhodobě stabilní. Proto bylo nutné vytříděné chromozomy během 3–4 hodin dopravit z Olomouce do Brna a dostat je do mikroskopu. To vyžadovalo dobrou koordinaci prací v obou laboratořích.

Přesto, že se jedná o velký objev, publikovali jste jej v časopise Scientific Reports, který, přestože spadá do vydavatelství Nature, nepatří mezi nejprestižnější časopisy (momentálně má impakt faktor 3,8). Nemířili jste trochu výš?

Snažili jsme se o lepší časopisy, ale trošku se nám nedařilo. Ten článek má totiž velký problém. Je to hybrid mezi metodickým a biologickým článkem. Jenže jedno bez druhého nedávalo smysl publikovat. Kdyby kolegové publikovali jenom metodu, recenzent by chtěl vidět, v čem je lepší než ty stávající. Kdybychom my publikovali jenom obrázky chromozomů, samozřejmě by chtěli vědět, jak je možné, že vidíme to, co druzí neviděli. Měli jsme za to, že je spravedlivé, když jsme na projektu společně pracovali, tak výsledky i společně publikovat. 

Všichni dnes volají po multidisciplinaritě, zároveň nejste první, kdo mi říká, že se články, které propojují více oborů, špatně publikují. 

Většinou to bylo tak, že redakce řekla, že to nebudou publikovat, právě kvůli velkému rozptylu oborů, a ne proto, že je to špatný článek. S mými letitými zkušenostmi už ale tahle odmítnutí snáším dobře.

Víte, já jsem měl k scientometrii vždy rezervovaný postoj. Asi proto, že jsem začínal v době, kdy nic takového neexistovalo. Tehdy jsme vždy publikovali v časopise, u kterého bylo zaručeno, že se informace dostanou k lidem, které dané téma zajímá. Můj desátý nejcitovanější článek má přes pět set citací, i když vyšel v časopise Biologia Plantarum, který má nízký impakt faktor (dlouhodobě se pohybuje mezi 1–2, pozn. red.). Nikdy mi to nevadilo, a vždycky jsem kolegům tvrdil, že každý, kdo bude chtít vidět naši práci, si ji najde. A Scientific Reports jsou online, takže si je může přečíst opravdu kdokoliv.

Už máte na článek nějaké ohlasy od kolegů ze světa?

Samotný článek už vidělo téměř čtyři tisíce zájemců. Tím, jak je článek hodně zmiňovaný v médiích a na sociálních sítích, přicházejí různá blahopřání. Ale je to tak čerstvá publikace, že až na vědeckých konferencích se o tom s kolegy pořádně pobavíme a začnou se plánovat navazující spolupráce.

Práce s pokusnými rostlinami vyžaduje často přesnost a trpělivost

Začátek konce

Vaše metoda izolace chromozomů pomohla k rozluštění genomů důležitých plodin, jako je pšenice nebo cukrová třtina. Jak k tomu došlo, že jste se do těchto mezinárodních projektů zapojili? 

Byl to nádherný pocit, když jsme přesvědčili celosvětovou komunitu, aby se ke čtení složitých genomů přistupovalo naší cestou. Přesvědčit Američany, že něco vyvinutého v Olomouci je lepší než jejich postup, to byl malý zázrak. 

Genomy se standardně čtou tak, že se jaderná DNA naštípe na menší části, ty se přečtou, jejich sekvence se skládají do delších úseků a přiřazují k jednotlivým chromozomům, na které je celý genom rozdělený. Mnoho plodin má velkou a složitou dědičnou informaci a například genom pšenice tvoří asi 15 miliard písmen genetické abecedy. Naše metoda celý proces sekvenování usnadňovala tak, že jsme pomocí průtokového cytometru izolovali jednotlivé chromozomy, kdy každý z nich představuje jen několik procent celého genomu, a teprve ty byly sekvenované. To je postup, se kterým jsme tenkrát přišli a dodnes jsme jediné pracoviště na světě, které umí chromozomy rutinně izolovat a třídit. 

Měli jsme velké štěstí, protože jsme s naší metodou přišli v době, kdy na rozdíl od dneška neexistovaly techniky a metody umožňující sekvenování a sestavování celých genomů, včetně těch velkých. Začali jsme s pšenicí a v roce 2003 jsme měli první poradu mezinárodního konsorcia ve Washingtonu, v roce 2014 pak vyšel v časopise Science první článek s pracovní verzí genomu a referenční verze genomu pšenice byla publikovaná ve stejném časopise v roce 2018. Pak to šlo ráz, na ráz: genom ječmene, žita, hrachu, cukrové třtiny…

K čemu používáte vaši techniku třídění chromozomů ve výzkumu nyní? 

Možnost izolovat konkrétní chromozom využíváme například v projektech zaměřených na izolaci důležitých genů. U pšenice to znamená, že namísto analýzy DNA všech 21 chromozomů tvořících její genom analyzujeme pouze chromozom, který nese hledaný gen. To celou práci zjednodušuje a urychluje. Ve spolupráci s mnoha zahraničními kolegy jsme přispěli k izolaci více než deseti genů, většinou odolnosti vůči devastujícím chorobám pšenice. A jejich počet dál roste.

V jiných projektech připravujeme čisté frakce velkých počtů všech chromozomů. Díky tomuto přístupu jsme vůbec poprvé identifikovali proteiny podílející se společně s molekulami DNA a RNA na stavbě chromozomů rostlin. Udělali jsme tak vlastně inventuru chromozomových proteinů, kterých je překvapivě více než osm set. Teď máme seznam a můžeme si z něj vybírat proteiny, které mohou mít zajímavou funkci, a hledat jejich polohu v těle chromozomu.

Analýza proteinů byla tak trošku rutina. Větší výzvou bylo zjistit, jak je v chromozomu uspořádaná molekula DNA. Například jeden chromozom ječmene nese DNA o délce asi 20 centimetrů, a přitom má délku jen několik tisícin milimetru! Jak je možné, že se tak dlouhá molekula do chromozomu vejde, nezamotá se, ani nepřetrhne a na konci buněčného dělení bezchybně rozvine v buněčném jádře dceřiné buňky? Izolace chromozomů nám vůbec poprvé umožnila odhalit, jak je DNA v chromozomu poskládaná. 

A jak?

Aby se molekula DNA vešla do buněčného jádra a posléze i do chromozomu, postupně kondenzuje. Nejprve se dvoušroubovice DNA obtáčí kolem jader z histonových proteinů, téměř dvě otáčky kolem každého z nich, a vytváří nukleozomové vlákno o průměru asi 11 nanometrů. Podle dřívější představy se mělo toto vlákno stáčet do solenoidu o průměru asi 30 nanometrů. Jenže vtip je v tom, že solenoid (solenoid je podlouhlá cívka se stejně hustými závity stejného kruhového tvaru po celé délce, pozn. red.), přestože byl pozorovaný in vitro, nebyl v podmínkách in vivo prokázaný. Takže panuje obecná shoda v tom, že neexistuje.

My jsme společně s kolegy z německého Gaterslebenu ukázali, že nukleozomové vlákno vytváří závity o délce asi 20–40 milionů písmen genetické abecedy a tloušťce asi 400 nanometrů, které jsou tvořeny vlákny o průměru 80 nanometrů. To vysvětluje, proč mají sesterské chromatidy, které tvoří chromozom v průběhu buněčného dělení, tvar válečku. Každá z nich je tedy tvořena asi 20 závity o tloušťce 400 nanometrů.

Vy jste ale před chvílí říkal, že výběžky, které jste pozorovali na živém chromozomu, jsou 30 nanometrů silné, což by znamenalo…  

Může to být jen náhoda a výběžky DNA neobsahují, anebo je to solenoid, který nemá existovat, ano… Takže jak se to řekne, je to začátek konce, nebo konec začátku? Alespoň víme, co bychom chtěli studovat dál.

Zobrazení povrchové struktury chromozomu s různými miniaturními výběžky a prostorově uspořádanými smyčkami vláken

Životní láska – banánovník

Vedle všech zmíněných plodin se také věnujete studiu genomu banánovníku, o kterém jste se vyjádřil, že je vaše nejoblíbenější rostlina. Co je na jeho genomu speciální? 

To je moje životní láska. Kdybych musel pracovat jen na jedné rostlině, tak si nechám banánovník. Je to nejenom krásná vitální rostlina, ale je navíc ekonomicky i kulturně strašně významná. Jsou země, ve kterých se jedna odrůda používá třeba na svatbu, jiná na pohřeb. Můj doktorand z Ugandy, kde je roční spotřeba banánů 400 kg na hlavu, mi říkal, že když si jeden den nedá jídlo připravené z banánu, není mu dobře. 

Genom banánovníku sám o sobě není možná až tak zajímavý, je malý, navíc se jeho DNA špatně izoluje. To, co je zajímavé, je jeho evoluce a struktura chromozomů. Je to nádherná souhra přírody s člověkem. Člověk si v průběhu evoluce vybíral různé typu banánů a ty pěstoval. Máme tak odrůdy se sladkými nebo škrobovými plody, a v přírodě rostou plané banánovníky s plody plnými semen. To, co člověk pěstuje, jsou kříženci různých druhů a podruhů banánovníku, přičemž u většiny z nich neznáme původ. Jeho odhalení by nám ale velmi pomohlo při šlechtění nových odrůd s lepšími vlastnostmi. Banánovník je pro mne také zajímavý tím, že na něm moc lidí na světě nepracuje.

Co je cílem studia banánu? Když jste říkal, že bychom chtěli vypěstovat nový, jsou současné druhy banánovníků nějak ohrožené?

Banánovník nejvíce ohrožuje půdní houba Fusarium oxysporum. Jedna její rasa v padesátých letech minulého století zničila všechny plantáže odrůdy Gros Michel ve střední Americe. Tato houba zůstává v půdě i desítky let a kontaminované pozemky nebylo možné dál využívat. Jen náhodou byla v té době objevena odrůda Cavendish, která byla vůči této rase odolná a odrůdu Gros Michel nahradila. Jenže souboj mezi rostlinami a jejich patogeny pokračuje a v Asii se objevila nová rasa téže houby, vůči které už odrůda Cavendish odolná není. Nová rasa houby se už dostala i do Ameriky a pokud se tam rozšíří, což je velmi pravděpodobné, produkci banánů na export kriticky ohrozí. 

Naštěstí se výzkumníci napříč světem začali mobilizovat a hledají řešení této hrozby. My se podílíme na velkém projektu, který financuje Gatesova nadace, a který má za cíl vyšlechtit nové, odolnější odrůdy pomocí klasického křížení. V Austrálii už byla získána geneticky modifikovaná odrůda Cavendish, která je vůči této rase půdní houby odolná. Problém je samozřejmě legislativa a postoj veřejnosti ke GMO plodinám. Je tak dobré mít alternativní strategii a využívat i klasické postupy šlechtění.

Noha ve dveřích

Vy jste velkým zastáncem GMO plodin. Evropská unie je na cestě k rozvolnění legislativy směrem ke genetickým úpravám plodin pomocí CRISP/Cas9 technologie (psali jsme zde). Máte z toho radost? 

Spolu s několika dalšími kolegy jsem se dokonce na návrhu nové evropské legislativy konzultačně podílel. Bohužel, v reakci na silnou opozici v evropském parlamentu, zůstal návrh legislativní úpravy v půli cesty: v podstatě bez omezení by mělo být možné provádět pomocí metody CRISPR/Cas9 či jiné metody editování genomu jen takové změny dědičné informace, kterých by bylo možné dosáhnout i klasickým křížením. Nadneseně řečeno, nemůžeme tedy vytvořit plodinu, která bude na povrchu země pšenice a v zemi brambora, ale můžeme vytvořit pšenici, která bude odolná vůči nějaké chorobě, protože její příbuzný druh vůči ní odolný je. Jen namísto 15 let křížení a přenášení rezistence z planého příbuzného druhu na pšenici, použijeme genetickou modifikaci a odolnou odrůdu získáme za mnohem kratší dobu. Není to tedy ideální, ale je to pomyslná noha ve dveřích. 

Vidíte u veřejnosti nějaký posun směrem k vnímání GMO? 

Vidím drobný posun. Už je méně protestů. Věřím, že v okamžiku, kdy si veřejnost zvykne na to, že potraviny získané z plodin s editovaným genomem jsou na trhu běžné, to znamená prověřené, nebude se tolik bát.  

Vidím to tedy optimisticky. Největší problém je, že svět nám utíká. Jsme hloupí, protože genetické úpravy plodin nabízí ohromné možnosti. V Evropě sice netrpíme nedostatkem potravin, ale mohly by být kvalitnější, mohli bychom mít menší ztráty na polích, rostliny by mohly mít lepší schopnost využívat živiny z půdy, tudíž by nebylo třeba tolik hnojit, byly by schopnější překonávat období sucha – to jsou všechno věci, kterých by se dalo pomocí genetických úprav dosáhnout a jinde ve světě tyto možnosti už využívají.

S kvalitou potravin souvisí i Strategie AV21 a její program Potraviny pro budoucnost, který koordinujete. Co je jeho cílem?

Asi před deseti lety přišel tehdejší předseda AV ČR profesor Drahoš se Strategií AV21, jejímž cílem bylo zviditelnit Akademii věd a urychlit přenos vědeckých výsledků do praxe. Náš program Potraviny pro budoucnost, který chce přispět k zajištění dostatku kvalitních potravin, spojuje různé vědní oblasti a obory od šlechtění plodin až po lidský mikrobiom a podílí se na něm osm pracovišť AV ČR a mnoho dalších mimo Akademii. Spektrum odborníků a profesí je velké a společně se snažíme poznatky z laboratoří dostat až ke šlechtitelům, producentům potravin, lékařům i pacientům. Daří se nám to a mám z toho obrovskou radost. 

Pokud jde o využití nejnovějších poznatků genetiky rostlin, byl v době zahájení našeho výzkumného programu hluboký příkop mezi základním a aplikovaným výzkumem a šlechtiteli. Začali jsme pořádat workshopy pro šlechtitele, ukazovali jsme jim laboratorní metody, a nyní už spolu mluvíme stejným jazykem a úspěšně spolupracujeme. Zřídili jsme Aplikační laboratoř pro zemědělský výzkum, jejímž posláním je spolupráce se šlechtiteli a pěstiteli zemědělských plodin. 

Pocházím z vesnice, studoval jsem zahradnictví, a i když jsem zahradníkem nikdy nebyl, neztratil jsem představu o tom, že existuje něco jako zemědělství, které nás živí, a že zemědělci potřebují nové odrůdy. V současné době zejména odolné vůči chorobám a škůdcům a změně klimatu. Vždycky mě těšilo, když naše výsledky měly přesah do praxe. 

Když říkáte, že jste nikdy nebyl zahradníkem, co pěstujete na zahradě?

To se ani neptejte. Tady platí, že kovářova kobyla chodí bosa. Na zahradě máme trávník a ten pravidelně seču. Pak nějaké stromy a keře, které rostou samy. Jediné, čím se můžu pochlubit, je malý skleník, ve kterém pěstuji rajčata. Jejich sazenice vždycky dostanu od paní sousedky. Nejsou to žádné hybridy ani roubovanci, ale plody mají výborné.

Můj tatínek byl zahradník, takže jsem se mu odrodil. Nikdy nevěděl, jestli má být pyšný na to, že pracuji v laboratoři, nebo má být naopak smutný, že nejdu v jeho šlépějích. Já sám jsem své volby nikdy nelitoval. Především proto, že jsem ve své práci měl vždycky velkou svobodu a mohl jsem studovat to, co mne zajímalo. To nemůže o svém povolání říct každý a vždy jsem si toto velké privilegium uvědomoval. Měl jsem zkrátka velké štěstí.

 

Autorka: Vendula Lužná (Vědavýzkum.cz) 

---

Jaroslav Doležel je rostlinný cytogenetik, který se celý život se věnuje studiu genetické informace rostlin. Díky jeho inovativní metodě třídění chromozomů pomocí průtokové cytometrie se se svým týmem podílel na přečtení genomů a izolaci genů důležitých zemědělských plodin, jako je pšenice, ječmen, žito nebo cukrová třtina. Vytvořil novou vědeckou školu – chromozomovou genomiku. Donedávna byl vedoucím Centra strukturní a funkční genomiky rostlin Ústavu experimentální botaniky Akademie věd ČR a vědeckým ředitelem Centra regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum (CRH) v Olomouci. V současnosti vede velký projekt „Nové poznatky pro plodiny nové generace (TANGENC)“ financovaný z OP JAK. Patří k nejcitovanějším českým vědcům a v roce 2018 obdržel nejvyšší české vědecké vyznamenání Národní cenu Česká hlava.