Ilustrativní obrázek vygenerovaný pomocí AI.
V listopadu loňského roku jsme přinesli článek o tom, že americká FDA (Food and Drug Administration) bude schvalovat první genovou terapii založenou na CRISPR/Cas technologii. Lék Casgevy, cílící na léčbu srpkovité anémie, byl nakonec v první polovině prosince 2023 schválen jak FDA, tak zhruba o týden později také evropskou EMA (European Medicines Agency).
Na začátku letošního roku vydal Evropský parlament pozici k návrhu nařízení Evropské komise, která prosazuje nový regulační rámec pro editace genomu zemědělských plodin pomocí CRISPR/Cas. Po vzoru amerických kontrolních úřadů by tak měly evropské regulační orgány rozlišovat dva druhy plodin, které mohou pomocí této technologie vzniknout: NGT1 (plodiny, u kterých došlo k úpravám genomu, které by mohly případně vzniknout i v přírodě) a NGT2 (na plodiny se složitějším zásahem do genomu, který by v přírodě byl méně pravděpodobný, bude i nadále nahlíženo jako na GMO). Jestliže tedy šlechtitelé pouze vyřadí nějaký gen z provozu a tím docílí například odolnosti plodiny vůči patogenům nebo pesticidům, nebude nutné danou plodinu kontrolovat tak přísně jako doposud. Ke schválení Evropským parlamentem došlo 7. února. Nyní ještě musí k návrhu nařízení přijmout pozici Rada EU, aby mohl být návrh nařízení na úrovni EU schválen, s čímž se bohužel počítá nejdříve příští rok, kvůli končícímu mandátu Evropského parlamentu a Komise.
Problematické aspekty CRISPR/Cas terapií
Přestože CRISPR/Cas začíná být již hojně využívaný šlechtitelský nástroj v zemědělské produkci, v případě genové terapie u lidí jsou regulační orgány se schvalováním léčiv stále opatrné, především kvůli tzv. off-target efektům, které mohou léčbu doprovázet.
Přesného zacílení technologie CRISPR/Cas při úpravách genomu je dosaženo pomocí tzv. naváděcí RNA, která v genomu vyhledá konkrétní místo, které je následně upraveno. Naváděcí RNA má většinou délku kolem 20 nukleotidů – musí tedy najít místo na DNA, které má shodné nukleotidy ve stejném pořadí. Přesto, že je díky takovému množství písmenek nukleové kyseliny velká pravděpodobnost, že se molekulární nůžky trefí přesně do místa, kam potřebujeme, může se stát, že se v genomu nachází více míst se stejným nukleotidovým uspořádáním. V takovém případě by nůžky stříhaly i mimo zamýšlený cíl – tedy v angličtině „off-target“.
Právě mapování off-target míst bylo součástí schvalování léku Casgevy. Přestože se však v lidském genomu nalezla i další místa, která odpovídala sekvencí navrhované naváděcí RNA, byla tato místa situovaná do intronů. Změny v nich ve většině případů nemají vliv na výslednou podobu proteinu. Casgevy tak dostal zelenou.
Z etického pohledu má technologie CRISPR/Cas ještě jeden problém. Stále neexistuje jasná celosvětová shoda na tom, zda provádět změny pouze v somatických buňkách – tedy tak, aby se nepřenesly na případné potomky. Přestože je zavedení CRISPR/Cas metod do úprav genomů výrazným milníkem současné vědy, vzhledem k některým jeho problematickým aspektům se na výsluní pomalu začíná dostávat nový druh terapie – editace RNA.
Ilustrativní obrázek vygenerovaný pomocí AI.
Editace RNA nabízí více možností i větší bezpečnost
Ribonukleových kyselin je v organismu velké množství a plní rozličné funkce. Například mRNA má za úkol dopravit informaci z DNA ven – z jádra buňky do cytoplasmy, kde je přeložena do podoby proteinů. Jestliže by tedy terapie cílila na úpravy RNA, byla by taková léčba bezpečnější a flexibilnější, než editace genomu pomocí CRISPR/Cas. Informace ukrytá v DNA by zůstala nedotknutá, nehrozilo by přenesení úpravy do dalších generací. Zároveň, vzhledem k variabilitě RNA, se nabízí širší spektrum možností případné léčby. Nevýhodou by bylo, že RNA není tak stabilní molekula jako DNA, po čase v buňce degraduje. Léčba by se tak musela pravděpodobně podávat opakovaně.
Stejně jako CRISPR/Cas metody mají svůj původ v bakteriích, také editování RNA je živým organismům vlastní. Poprvé byly přirozeně se vyskytující editace RNA popsané v roce 1987. Změny v nukleotidech RNA se v organismech odehrávají především díky komplexu proteinů ADAR (Adenosine deaminases acting on RNAs). V těle savců existuje ADAR proteinů hned několik. Přirozeně se vyskytující modifikace RNA molekul mohou vést například ke vzniku různě dlouhých RNA, což následně ovlivňuje jejich lokalizaci v rámci buňky, stabilitu nebo aktivitu. V některých případech může být editace RNA nutná pro normální fungování organismu. Nezbytnost existence editačního mechanismu je doložena experimenty, kdy odstranění ADAR proteinů bylo u myší pozorováno jako letální.
Nové terapie založené na editaci RNA
Možností, jak využít editaci RNA k léčbě genetických onemocnění, je hned několik. Jestliže se mutace nachází v DNA, bude přepsána také do mRNA. Pokud by se v tomto kroku mutace opravila, namísto poškozeného by vznikl funkční protein, případně by se dala zvýšit jeho produkce. Hned několik terapií, založených na editaci RNA, získalo v nedávné době povolení klinických testů na lidech.
Firma Wave Life Sciences ze státu Massachusetts zkoumá jednonulkeotidovou změnu v RNA, která by mohla léčit onemocnění zvané alpha-1 antitrypsin deficiency (AATD). To vede k poškození plic a jater. Důvodem onemocnění je snížení produkce proteinu AAT, který chrání organismus před toxiny. Tato firma využívá právě přirozeně se vyskytující ADAR proteiny, aby změnily danou mutaci a organismus si vytvořil funkční protein. Na myším modelu se jim podařilo dosáhnout 50% úspěšnosti v editaci cílové mRNA, což bylo dostatečné pro léčebný efekt terapie. Klinické testování započalo v prosinci 2023 ve Velké Británii a Austrálii.
První terapie založená na RNA editování, která získala na začátku letošního roku povolení ke klinickému testování americkou FDA, je léčba Stargardtovy choroby. Jedná se o genetické onemocnění sítnice vedoucí často k úplné ztrátě vidění již v dětském nebo adolescentním věku. Tato choroba je způsobena poměrně velkým počtem mutací v jednom genu. Výsledkem je poškozený protein, který není schopen chránit sítnici před poškozením. Právě onemocnění, která jsou geneticky podmíněná, ale zároveň způsobena více mutacemi v jednom nebo více genech, dosud unikala klasickým postupům genové terapie. Ta většinou cílila spíše na onemocnění, kde byl problém na jednom místě jednoho genu.
Preparát firmy Ascidian Therapeutics z Bostonu je schopen opravit všechny mutace v genu způsobující Stargardtovu chorobu, což vede k tvorbě „zdravého“ proteinu. Metoda je založená na tzv. editování exonu. Molekula mRNA obsahuje kódující sekvence, které nesou informaci o podobě výsledného proteinu – exony; a nekódující sekvence, které jsou následně vystřiženy pomocí tzv. sestřihu – introny. Až správně sestříhané exony se následně přepisují do podoby proteinů. Léčba navržená firmou Ascidian je založená na zásahu do průběhu sestřihu mRNA, kdy buňku donutí mutovaný exon nahradit „správným“.
Vedle genetických onemocnění se metody editace RNA obrací také k léčbě rakoviny. Korejská firma Rznomics započala v září 2022 v Jižní Koreji klinické testy terapie, která je založena na sestřihu mRNA molekuly, kterou produkují rakovinné buňky. Jejich preparát rozstřihne mRNA rakovinné buňky a vloží do ní informaci pro toxin. Při tvorbě proteinu si potom nádor sám tvoří toxický protein, který jej zabíjí.
Pohánění covidovými vakcínami
Za rozmachem využití RNA editování pro léčebné účely stál především úspěch mRNA vakcín proti covid-19. Ty ukázaly, že využití RNA k terapeutickým účelům je bezpečné a účinné zároveň. A na úspěchu covidových vakcín staví také další očkovací látky, které využívají mRNA technologii.
V současné době se vyvíjejí mRNA vakcíny například proti Zika viru, Cytomegaloviru, HIV nebo viru chřipky. Dalším slibným cílem mRNA vakcín jsou některé druhy rakoviny. V různých fázích vývoje jsou například vakcíny proti rakovině vaječníků, prostaty, prsu nebo melanomu. Vedle toho pracují farmaceutické společnosti na vylepšování současných mRNA vakcín proti covid-19.
A tak zatímco CRISPR/Cas se zdá být ideálním řešením na poli šlechtitelství a rostlinné biologie, zavádění genových terapií u lidí založených na této metodě stále čelí řadě etických otazníků a technických překážek. Také RNA terapie mají samozřejmě svá potenciální úskalí, která se budou postupně odhalovat především v průběhu klinických testů zmíněných preparátů. Zdá se však, že právě editování RNA by mohlo nabízet zajímavou alternativu pro léčbu nejen genetických onemocnění. Svět RNA molekul – díky své variabilitě a zapojení do velkého množství procesů napříč buňkou, nabízí celou řadu možností pro budoucí terapeutické využití.
Autorka: Vendula Lužná (Vědavýzkum.cz)
Zdroje: Springer Link, Nature, Cell, BioSpace, FDA, EMA, Labiotech, Science, Nature2
