Jan Křivánek: Čtyři geny stačí k nastartování tvorby zubu

V rámci výzkumné skupiny se dlouhodobě věnujete výzkumu kmenových buněk a na modelu kontinuálně rostoucích myších zubů se zabýváte vývojem a regenerací tkání. Můžete aktuální studii zasadit do kontextu vašeho dosavadního výzkumu?

Už dřív se nám podařilo detailně popsat vývoj odontoblastů, a to z kmenových buněk přes několik mezistupňů, až do buněk, které skutečně tvoří zub. Na úrovni genové exprese jsme popsali, které geny se v různých fázích tohoto procesu zapínají a vypínají. V aktuální práci jsme se zaměřili na tzv. regulační neboli řídicí geny.

Můžete přiblížit, co to je za geny, a proč právě na ně?

Bývají označovány taky jako transkripční faktory nebo regulátory. Jde o geny, které mají na starost kontrolu toho, jak se budou chovat jiné geny. Ovlivňují řádově desítky až stovky dalších genů – proto řídicí geny. Vytipovali jsme čtyři z nich, které dřív vůbec nebyly spojovány s vývojem zubu, a zkoumali jsme, co se stane, když je vložíme a cíleně aktivujeme u pluripotentních kmenových buněk, tedy buněk schopných dát vzniknout jakýmkoliv buňkám a tkáním v našem těle.

Co jste tak chtěli zjistit a proč je to zásadní?

Zajímalo nás, jestli aktivací těchto genů dosáhneme toho, aby kmenové buňky daly vzniknout buňkám utvářejícím zub. Ukázalo se, že ano. Tato práce dokázala nezbytnost a sílu základního výzkumu. Prokázali jsme, že pochopení určitého vývojového procesu v živém organismu, může otevřít cestu pro cílené aplikace v tkáňovém inženýrství nebo při získávání konkrétních buněčných typů.

Jestliže se uvádí, že člověk má dvacet až pětadvacet tisíc genů, kolik z nich jsou tyto regulační geny? A jak jste vybrali konkrétní čtyři, jestliže v minulosti nebyly dávány do souvislosti s vývojem zubních tkání?

Řádově jich je kolem tisíce. Naše čtyři jsme vybrali na základě analýzy genové exprese na úrovni jednotlivých buněk. Díky naší dřívější analýze kontinuálně rostoucích myších zubů už dokážeme zjistit přesnou genovou expresi v každé jednotlivé buňce. Umíme říct, které buňky stojí na začátku vývojového procesu, které v jeho průběhu a které na konci, a zároveň i to, které geny jsou v těchto stádiích exprimované. 

Na základě čeho tento vývoj dělíte do fází? Má nějaké milníky?

To je dobrá otázka, protože ten proces je naprosto fluidní. Na základě procesů, jako je třeba právě odlišná genová exprese, ho však dokážeme rozdělit na různé mezistupně. Samozřejmě ale i mezi dvěma námi vytyčenými mezistupni existují další stavy buňky, které takto jednoduše zařadit nelze. Jde tedy i o naše nastavení vybraných parametrů a je vlastně paradox, že čím víc informací máme, tím spíš vidíme, jak pomíjivý ten proces je. Pokud bychom sledovali expresi jen jednoho či dvou genů, tak si ty mezistupně vymezíme snáz.

Takže je to podobné, jako když antropologové oznámí, že někde v jeskyni našli chybějící vývojový mezistupeň člověka, ale ve skutečnosti si nemůžeme být jisti, kolik takových mezistupňů vlastně je…

…anebo můžeme použít přirovnání k duze. Na první pohled v ní vidíme například žlutou a červenou barvu, když se však podíváme podrobněji, spatříme mezi nimi ještě oranžovou. A kdybychom se dál dívali mezi oranžovou a žlutou, najdeme další odstíny, kterých může být prakticky nekonečně.

Mluvíte o zapínání a vypínání genů, respektive jejich aktivaci a deaktivaci. Jak ho provádíte? Byť asi pro kolegy vědce to bude samozřejmá odpověď…

Až tak samozřejmá být nemusí, přístupů totiž existuje víc. My jsme pracovali s lentiviry, což je rod retrovirů, které mohou způsobovat například HIV. Pro nás je zásadní, že jde o viry, které dokážou svou DNA napevno včlenit do svého hostitele. Mají kapacitu pro nesení cizorodé genetické informace, tzv. cargo space, do které vpravíme sekvenci vybraného genu. Vzniklým virionem infikujeme kmenové buňky, a tímto způsobem do jejich genomu dostaneme požadovanou genetickou informaci. Pak už jen populaci takto upravených buněk například s pomocí antibiotika nebo cell sortingu vyselektujeme a získáme relativně čistou populaci buněk nesoucích geny, které nás zajímají.

Kde získáváte ony lentiviry?

Dřív si je každá laboratoř klonovala „doma“, což je ale velice zdlouhavý proces. Dnes už naštěstí existují firmy, které takový virus dokáží vytvořit dle zadání na zakázku. My jsme zvolili snazší komerční cestu. Prakticky to znamená, že u počítače designujeme požadovanou sekvenci viru, a pak už jen čekáme na zásilku v podobě zkumavky, se kterou následně můžeme pracovat, jak potřebujeme.

Jestliže jste se ale zaměřili na čtyři regulační geny, pracovali jste s více variantami, ne?

Ano, onen cargo space je poměrně limitovaný. Buňky jsme infikovali celkem třemi různými viriony a vytvořili tak několik kombinací. Čtyři geny jsme rozdělili po dvou – dva ranější, plus dva pozdnější – a třetí konstrukt pak sloužil k jejich zapínání. Když totiž naši cizorodou DNA, tedy tyto čtyři geny, dostaneme do buněk, defaultně v nich jsou neaktivní. Až ošetření doxycyklinem, což je antibiotikum, způsobí, že se geny zapnou a začnou fungovat. V první kombinaci jsme měli aktivní dvojici raných genů, v druhé dvojici pozdnějších genů a ve třetí všechny čtyři. Následně jsem v rámci týdnů až měsíce analyzovali, jak se které nastavení projeví.

Když si pomůžu terminologií z IT, vlastně jste prostřednictvím ovlivňování aktivity genů pro ty kmenové buňky psali takový skript…

Ano, ale velice hrubý skript. Na první pohled se to nemusí zdát, ale pro ty buňky jde o dost velké zásahy. Oněch dvacet tisíc genů, které v sobě máme a které kódují stavbu všech našich proteinů, není zas tak velké množství. Kromě nich však existují ještě další, nekódující geny nebo regulační sekvence, které určují genovou expresi, a tyto regulační sekvence mají zase svoje nadřazené sekvence, které je ovlivňují… V součtu to jsou miliardy proměnných, takže abychom prováděli nějaký fine-tuning, u toho ještě nejsme. (směje se)

V každém případě, přimět kmenové buňky k tomu, aby začaly vytvářet molekuly typické pro odontoblasty a v další fázi dokonce kolagen a mineralizovanou tkáň, se vám podařilo. Jaká je souvislost těchto procesů?

Odontoblast je buňka, která tvoří dentin neboli zubovinu, což je hlavní tvrdá hmota zubu, tvořená z velké části kolagenem, který na sebe váže molekuly hydroxyapatitu, čímž se dentin vytvrzuje. Takže to, že buňka začne vytvářet kolagen, je první známka toho, že by z ní mohl vzniknout odontoblast. V druhé fázi jsme zjistili, že naše buňky jsou kromě kolagenu schopné tvořit mineralizující ložiska, že se v nich ukládá vápník. Obdobný, ale ne totožný proces probíhá i při tvorbě jiných tvrdých tkání.

Nakolik zásadní je, že jste tento proces dokázali sledovat i v živé myši?

Nejdřív jsme si dali za cíl vytvořit organoid/sferoid nebo jak se někdy říká tzv. miniorgán. Ačkoliv se s těmito systémy dnes hojně pracuje, tak mají jednu zásadní nevýhodu. Tyto „ve zkumavce“ kultivované struktury nejsou vaskularizované, inervované a nepůsobí zde buňky imunitního systému nebo fyzikální vlivy prostředí, takže plně nereflektují, co se v našich živých tělech děje. Abychom lépe napodobili přirozené prostředí živých organismů, tak jsme námi vytvořené organoidy vpravili pod ledvinovou kapsulu imunodeficientní myši, tedy myši schopné přijmout za vlastní i cizí tkáně. Myš náš implantát vaskularizovala a on se tak mohl dále vyvíjet. Přiblížili jsme se tak zase o něco blíž situaci, která se děje v živém organismu.

Překvapilo vás zjištění, že in vitro nastartované procesy probíhají dál i v živé myši?

Bylo to zjištění, které jsme slavili! (usměje se) Šlo o velmi rizikový projekt, spadající do kategorie high-risk / high-gain. Doufali jsme, že se naše hypotéza naplní, ale zhatit to mohlo tisíc dalších věcí. Že se potvrdila, bylo, nechci říkat vyloženě nečekané, ale rozhodně velice příjemné zjištění.

Jaké bývá zklamání, když se tak nestane?

Ke zklamání samozřejmě dochází vždy, i v mnoha fázích tohoto projektu. Podle mě je klíčem být připravený, experimentálně robustní a nehroutit se, jestliže se nějaký experiment nepovede. Budeme-li se bavit o projektech typu high-risk / high-gain povahy, tak z mojí zkušenosti plyne, že možná osm z deseti jich selže nebo nikam nevede. Ty zbylé dva naopak ukážou něco nového, zajímavého, něco, co třeba ještě nikdo dříve neviděl a za čím stojí dál jít. A dělat experimenty, u nichž předem nevíme, jak dopadnou, je to, co nás na vědě baví.

Bylo ještě něco, co vás v projektu překvapilo?

Určitě to, že některé z těch nově vzniklých buněk získaly i znaky jiných buněk. Krom toho, že exprimovaly geny charakteristické pro odontoblasty a byly schopné tvořit kolagen, exprimovaly taky například geny charakteristické pro epitelové buňky tvořící třeba kůži. 

O čem to svědčí?

Zajímavé to je z více důvodů. Buňky, které by exprimovaly takovou kombinaci genů, totiž v našem těle neexistují. Vytvořili jsme tak jakýsi buněčný hybrid. U myší se může například stát, že když u buněk tvořících zubní sklovinu dojde k malému posunu v genové expresi – k němuž dochází i u jinak zdravých myší –, tak té myši vedle zubů vyrostou chlupy. Z toho plyne, že i malá změna v genové expresi může způsobit zásadní změnu v cílovém fenotypu – zub versus chlup. Není to zajímavé?

Když jsme se před dvěma roky bavili o metodě BEE-ST, která vám umožňuje sledovat rychlost růstu tvrdých tkání v reálném čase, zmiňoval jste spolupráci s kolegy z jiných pracovišť a její aplikaci i u jiných modelových organismů, nejen u myší. Má nový projekt podobný přesah?

Určitě ano. Spočívá hlavně v tom, že jsme na modelu vývoje zubu ukázali nový způsob, jak lze získávat terminálně diferencované buňky neboli funkční buňky z buněk kmenových. V našem případě jsou to odontoblasty, ale věřím, že pokud by se pečlivě vybrala kombinace transkripčních faktorů, mohlo by být možné podobným způsobem získat i jiné buněčné typy, ať už třeba neurony nebo beta buňky pankreatu…

Konkrétně beta buňky pankreatu už prý vědci dokáží upravit a přimět k tomu, aby produkovaly inzulin. V čem je váš přístup tak zásadně odlišný?

Ano, to se skutečně děje. Podobné experimenty ale typicky probíhají tak, že je genová exprese buněk ovlivněna působením například nějakého proteinu nebo malou molekulou, tedy vnějším způsobem. Náš postup je metodologicky jiný v tom, že jsme šli přímo dovnitř genomu. Zasáhli jsme do pluripotentních kmenových buněk, tedy buněk s potenciálem dát vzniknout úplně jakýmkoliv buněčným typům, tím, že jsme do nich vložili vybrané transkripční faktory, ony regulační geny. A ukázali jsme, že vybereme-li správné transkripční faktory, dokážeme diferenciaci, tedy proměnu těchto buněk, ovlivnit.

Jak při podobných projektech pracujete s rizikem, že se z vámi ovlivněných buněk sice stanou odontoblasty, ale časem třeba mohou být nestabilní…?

To se samozřejmě stává. Je třeba říct, že my jsme se nesnažili vynalézt nový terapeutický postup, chtěli jsme zjistit, jak věci fungují a ukázat možný směr, kterým se vydat. Ne všechny buňky, které byly naším postupem ovlivněny, daly vzniknout odontoblastům. Vždycky vznikla nějaká směsná populace. Nebylo to tak, že by se všechny buňky najednou změnily a vytvořily odontoblasty. Hlavním výstupem naší práce bylo, že jsme prokázali, že geny Sall1, Etv4, Nupr1 a Gsc jsou nezbytné při diferenciaci odontoblastů.

Máte vysvětlení pro to, proč se některé z buněk nediferencovaly?

Biologie bohužel není matematika, kde je každý krok jasně determinovaný – alespoň dle mé bídné znalosti matematiky… (směje se) V buněčné/molekulární biologii přirozeně funguje například něco, čemu se říká gene silencing. Tento proces vede k tomu, že některé geny, například geny, které do buněk vložíme, se mohou vnitřními mechanismy samy umlčovat. Jde o vnitřní kontrolu organismu, aby fungoval, jak má. Záleží i na tom, do které části genomu naši sekvenci vložíme, což pak může ovlivnit další věci. Proměnných je mnoho a výsledný efekt může být značně variabilní.

O tomto projektu jste se zmiňoval už před dvěma lety, ale tehdy jste o něm ještě nemohl prozradit víc. Můžete naznačit, nad čím bychom se mohli sejít dejme tomu za další dva roky?

(usměje se) Tento projekt byl, dá se říct, samostatně stojící. Nečekáme tedy, že bude mít jasný follow-up přímo v naší laboratoři. Diskutovali jsme však naše výsledky například s jedním kolegou z Kanady, kterého zajímá, jak naše vybrané čtyři geny ovlivňují genovou expresi i na základě jiných regulačních sekvencí a chtěl by s námi na toto téma spolupracovat. Dohromady jsme však na tomto projektu pracovali asi šest let a během té doby jsme rozjeli desítky dalších projektů, takže doufám, že se časem zase u něčeho, snad zajímavého, setkáme.

Autor: Václav Tesař 

Zdroj: Masarykova univerzita

Jan Křivánek vede na Ústavu histologie a embryologie Lékařské fakulty Masarykovy výzkumnou skupinu zaměřenou na vývojovou biologii a výzkum kmenových buněk Jako ústřední modelový systém využívá kontinuálně rostoucí myší zuby, zejména pro jejich schopnost regenerace a reparace. Působil ve švédském Institutu Karolinska či na Lékařské univerzitě ve Vídni. Je autorem projektu Dental cell type atlas, interaktivní databáze zubních buněk.